MTT 어세이

MTT 어세이(MTT assay)는 세포 대사 활동을 평가하기 위한 비색 분석이다.^[1]

NAD(P)H 의존성 세포 산화 환원 효소는 정의된 조건에서 존재하는 생존 세포의 수를 반영할 수 있다. 이 효소는 테트라졸륨 염료 MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드를 보라색을 갖는 불용성 포르마잔으로 환원시킬 수 있다. XTT, MTS, WST를 포함한 기타 밀접하게 관련된 테트라졸륨 염료는 중간 전자 수용체인 1-메톡시 페나진 메토설페이트(PMS)와 함께 사용된다. 세포 불투과성인 WST-1을 사용하면 원형질막 전자 전달을 통해 세포 외부에서 환원된다.^[2] 이러한 기존 설명은 현재 MTT가 산화환원효소의 명백한 관여 없이 지질 세포 구조에서 포르마잔으로 환원된다는 증거가 발견되었기 때문에 나온다.^[3]

Tetrazolium 염료 분석은 또한 잠재적인 약제 및 독성 물질의 세포독성(생존 세포 손실) 또는 세포 증식 억제 활성(증식에서 정지로의 이동)을 측정하는 데 사용할 수 있다. MTT 시약은 빛에 민감하기 때문에 MTT 분석은 일반적으로 어두운 곳에서 수행된다.

정의[편집]

Tetrazolium 염료[편집]

노란색 테트라졸인 MTT는 살아있는 세포에서 보라색 포르마잔으로 환원된다.^[4]

XTT(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)가 MTT를 대체하여 더 높은 감도와 더 높은 동적 범위를 제공하는 것으로 제안되었다. 형성된 포르마잔 염료는 수용성이므로 최종 가용화 단계를 피할 수 있다.^[5]

수용성 테트라졸륨 염은 MTT에 대한 보다 최근의 대안이다. 이들은 테트라졸륨 염의 페닐 고리에 양전하 또는 음전하 및 히드록시기를 도입하거나 페닐 고리에 직접 또는 간접적으로 추가된 설포네이트 기를 사용하여 개발되었다.

MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨)는 페나진 메토설페이트(PMS)의 존재 하에 포르마잔을 생성한다. 인산완충식염수에서 최대 흡광도가 490 nm인 제품. MTS 분석은 종종 '원스텝' MTT 분석으로 설명되며, MTT 분석에 필요한 간헐적 단계 없이 시약을 세포 배양에 바로 추가할 수 있는 편리함을 제공한다. 그러나 MTT 분석의 간헐적 단계가 미량의 유색 화합물을 제거하기 때문에 이러한 편리성으로 인해 MTS 분석이 비색 간섭에 취약한 반면, 이들은 1단계 MTS 분석에서 미세역가 플레이트에 남아 있다. 이 분석법을 사용할 때 정확성을 보장하기 위해 예방 조치가 필요하며 현미경으로 정성적 관찰을 사용하여 MTS 결과를 확인해야 한다는 강력한 주장이 있다.^[6]

WST(수용성 테트라졸륨 염)는 형성된 포르마잔의 다른 흡수 스펙트럼을 제공하기 위해 개발된 MTT 분석을 위한 일련의 기타 수용성 염료이다.^[7] WST-1 및 특히 WST-8(2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨)은 MTT보다 유리하다. PMS 전자 매개체와 결합하여 세포 외부에서 환원되어 수용성 포르마잔을 생성한다. 이 분석의 특징은 다음과 같다.

(가용화 단계가 필요한 MTT와 달리) 직접 읽을 수 있다.
MTT보다 더 효과적인 신호를 제공한다.
세포에 대한 독성을 감소시킬 수 있다(세포 투과성 MTT 및 불용성 세포 내부에 축적되는 포르마잔).

측정[편집]

방법[편집]

MTT assay는 위에서 언급된 MTT 염료를 이용한다. 가용화 용액(보통 디메틸 설폭사이드, 산성화된 에탄올 용액 또는 묽은 염산에 세제 나트륨 도데실 설페이트 용액)을 첨가하여 불용성 보라색 포르마잔 생성물을 착색 용액에 용해시킨다. 이 착색 용액의 흡광도는 분광 광도계로 특정 파장(보통 500~600nm)에서 측정하여 정량화할 수 있다. 빛의 흡수 정도는 세포 내부와 세포 표면에 축적된 포르마잔 농도의 정도에 따라 다르다. 포르마잔 농도가 높을수록 보라색이 짙어지며 흡광도가 높아진다.

해석[편집]

위에서 이야기한 것처럼 테트라졸륨 염료 환원은 일반적으로 세포의 세포질 구획에서 주로 NAD(P)H 의존성 산화환원효소에 의존하는 것으로 가정된다.^[2] 따라서 MTT 및 기타 테트라졸륨 염료의 감소는 NAD(P)H 플럭스로 인한 세포 대사 활성에 따라 달라진다. 흉선 세포 및 비장 세포와 같이 대사가 낮은 세포는 MTT를 거의 감소시키지 않는다.

대조적으로, 빠르게 분열하는 세포는 높은 MTT 감소율을 나타낸다. 분석 조건은 세포 생존에 영향을 미치지 않으면서 대사 활동을 할 수 있어야 한다. 따라서 테트라졸륨 염료 감소를 변경할 수 있음을 명심하는 것이 중요하다.

또한, 테트라졸륨 염료의 환원 메커니즘, 즉 세포내(MTT, MTS) 대 세포외(WST-1)도 생성물의 양을 결정한다. 또한, 효소 촉매 작용 없이 지질 세포 구획/구조에서 자발적인 MTT 감소에 대한 증거가 제공되었다.^[3] 그럼에도 불구하고, 이러한 대안적 패러다임에서도 MTT 분석은 여전히 세포의 환원 가능성(즉, 세포 에너지를 구동하기 위한 환원 화합물의 가용성)을 평가하는데 중요한 지표가 된다.^[1] 따라서 최종 세포 생존력 해석은 변한다.

3D 섬유 스캐폴드에 시드된 세포의 생존 가능성을 연구할 때 스캐폴드의 두께가 MTT 분석 결과에 영향을 미칠 수 있다.

각주[편집]

↑ ^가 ^나 Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A (April 2018). "Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives" (PDF). Acta Histochemica. 120 (3): 159–167. doi:10.1016/j.acthis.2018.02.005. PMID 29496266.
↑ ^가 ^나 Berridge MV, Herst PM, Tan AS (2005). "Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction". Biotechnology Annual Review. 11: 127–52. doi:10.1016/S1387-2656(05)11004-7. ISBN 9780444519528. PMID 16216776.
↑ ^가 ^나 Stockert, Juan C.; Blázquez-Castro, Alfonso; Cañete, Magdalena; Horobin, Richard W.; Villanueva, Ángeles (2012년 12월). “MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets”. 《Acta Histochemica》 114 (8): 785–796. doi:10.1016/j.acthis.2012.01.006. ISSN 0065-1281.
↑ Mosmann, Tim (1983년 12월). “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays”. 《Journal of Immunological Methods》 65 (1-2): 55–63. doi:10.1016/0022-1759(83)90303-4. ISSN 0022-1759.
↑ "Why should I use XTT instead of MTT" (PDF, 0.1 MB). [aniara.com]. ANIARA. Retrieved 2010-11-19.
↑ Cory, Ann H.; Owen, Terence C.; Barltrop, John A.; Cory, Joseph G. (1991년 7월 1일). “Use of an Aqueous Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth Assays in Culture”. 《Cancer Communications》 3 (7): 207–212. doi:10.3727/095535491820873191. ISSN 0955-3541.
↑ "Water Soluble Tetrazolium Salts (WSTs)" (PDF, 0.4 MB). [interchim.com]. Interchim. Retrieved 2013-08-12.

[:0-1] 가 ^나 Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A (April 2018). "Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives" (PDF). Acta Histochemica. 120 (3): 159–167. doi:10.1016/j.acthis.2018.02.005. PMID 29496266.

[:1-2] 가 ^나 Berridge MV, Herst PM, Tan AS (2005). "Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction". Biotechnology Annual Review. 11: 127–52. doi:10.1016/S1387-2656(05)11004-7. ISBN 9780444519528. PMID 16216776.

[:2-3] 가 ^나 Stockert, Juan C.; Blázquez-Castro, Alfonso; Cañete, Magdalena; Horobin, Richard W.; Villanueva, Ángeles (2012년 12월). “MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets”. 《Acta Histochemica》 114 (8): 785–796. doi:10.1016/j.acthis.2012.01.006. ISSN 0065-1281.

[4] Mosmann, Tim (1983년 12월). “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays”. 《Journal of Immunological Methods》 65 (1-2): 55–63. doi:10.1016/0022-1759(83)90303-4. ISSN 0022-1759.

[5] "Why should I use XTT instead of MTT" (PDF, 0.1 MB). [aniara.com]. ANIARA. Retrieved 2010-11-19.

[6] Cory, Ann H.; Owen, Terence C.; Barltrop, John A.; Cory, Joseph G. (1991년 7월 1일). “Use of an Aqueous Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth Assays in Culture”. 《Cancer Communications》 3 (7): 207–212. doi:10.3727/095535491820873191. ISSN 0955-3541.

[7] "Water Soluble Tetrazolium Salts (WSTs)" (PDF, 0.4 MB). [interchim.com]. Interchim. Retrieved 2013-08-12.

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